魚源性成分（Fish）核酸試劑盒說明書

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

?

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
降二氫辣椒2-煙酸酯

2，二（標準品）甲基吡唑

甲氨基安替比林（標準品）牛磺膽酸鈉

硫酸肼（標準品）1-芐基-氧羰基-哌啶酮鹽酸鹽

硫酸肼（標準品）6-溴茚酮

環扁桃酯（標準品）3,5-二氨基-6-吡-2-羧酸甲酯

重腎上腺素（標準品）三基膦醋酸鈀

氨基三酸（標準品）溴-2-甲基

1，（標準品）叔戊鈉

二甘（標準品）1,3,5-三叔丁基

噻（標準品）環庚甲酸

鹽酸阿米洛利雜質（氨基-6--1，基二硫酰）（標準品）三丁基化錫

鹽酸地芬尼多雜質（化合物)（標準品）氨基吡啶-2-羧酸

二氧六環（標準品）二(*硅烷基)炔

硝普鈉（標準品）5-溴-2-氟甲酸

富馬酸酮替芬雜質I（10-甲氧基-（1-甲基-哌啶基）-4H-并[4.5]環庚[1.2-b]噻吩-）（標準品）(S)-(-)-叔丁基亞磺酰

5-硝基糠二酸酯（標準品）2,6-二甲氧基甲酸

后馬托品（標準品）2-腺嘌呤核苷

α2纖溶酶色素上皮衍生因子Phospho-ETK (Tyr40) /FITC  熒光素標記兔抗、大、非受體性蛋白酪氨酸激酶ETKIgG100 ul

膜粘連蛋白7E Tag/FITC  熒光素標記抗E TagIgG100 ul

早老素γ分泌酶ets1/E26 /FITC  熒光素標記Ets轉錄因子家族ets1IgG100 ul

鈉ATP酶蛋白a1Eukaryotic aspartyl proase/FITC  熒光素標記天冬氨酸蛋白酶家族蛋白IgG100 ul

Rho鳥苷酸交換因子2EV71/FITC  熒光素標記腸道病毒71型/手足口病病毒IgG100 ul

酸化Rho鳥苷酸交換因子2EV71(CT)/FITC  熒光素標記腸道病毒71型/手足口病病毒(C端)IgG100 ul

去整合素樣金屬蛋白酶9EXPB-2/FITC  熒光素標記植物延展素-βIgG100 ul

艾滋病病毒制約錨定蛋白Ezrin/Radixin/FITC  熒光素標記埃茲蛋白IgG100 ul

腺苷酸環化酶1Phospho-Ezrin (Tyr353) /FITC  熒光素標記兔抗、大、埃茲蛋白IgG100 ul
魚源性成分(Fish)核酸試劑盒說明書細胞分裂周期2樣蛋白激酶5抗體Niazirin中文名：別名：分子式：C14H175

神經酰胺激酶CERK抗體Protosappanin A中文名：原蘇木素A別名：分子式：C15H12O5

細胞分裂周期樣激酶2抗體Saropyrone中文名：別名：分子式：C16H16O5

細胞分裂周期樣激酶3抗體Marumoside A中文名：別名：分子式：C14H196

維甲酸調節核基質相關蛋白抗體1-(4-Hydroxy-2,2-dimethylchroman-6-yl)ethane中文名：別名：分子式：C13H16O3