熒光-PCR法的相關(guān)數(shù)據(jù)處理常識(shí)要弄清

更新時(shí)間：2022-10-17

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　　實(shí)時(shí)熒光-PCR法是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的技術(shù)。它通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。

　　對(duì)熒光-PCR法的數(shù)據(jù)處理我們要了解一個(gè)關(guān)鍵的因素“Ct值”。在實(shí)時(shí)定量PCR的數(shù)據(jù)圖中，x-軸表示PCR循環(huán)數(shù)，y-軸表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值，也就是擴(kuò)增產(chǎn)物的量。這個(gè)圖中有基線、閾值、Ct值這幾個(gè)概念，從這幾個(gè)值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。

　　基線是擴(kuò)增曲線中的水平部分。在反應(yīng)初階段，雖然產(chǎn)物是指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，但是由于總量太少，其熒光處于背景水平，檢測(cè)不到熒光增加。因此基線信號(hào)的產(chǎn)生是由于測(cè)量的偶然誤差引起的。然而當(dāng)累積了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，足以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)時(shí)，這個(gè)信號(hào)的值就被稱為閾值，通常閾值默認(rèn)為基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10。在閾值的前后，PCR的反應(yīng)仍然是指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的，因此此時(shí)的PCR結(jié)果可靠，可以準(zhǔn)確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)，也就是擴(kuò)增曲線與閾值的交叉點(diǎn)。

　　為什么知道了Ct值就能夠得到初的目的基因含量呢？

　　一個(gè)基因的單次反應(yīng)擴(kuò)增曲線中要計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)N，它等于模板的分子數(shù)乘以1+擴(kuò)增效率的n次方，n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說(shuō)，如果擴(kuò)增效率為100%，產(chǎn)物分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是顯然，在線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，擴(kuò)增效率不可能是100%，因此上述PCR理論方程只在指數(shù)期成立。