細(xì)胞凋亡DNA Ladder提取試劑盒(柱式吸附)

商品介紹：

本試劑盒是目前先進(jìn)的DNA Ladder抽提試劑盒之一。本試劑盒是針對細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的核小體間DNA鏈斷裂而設(shè)計(jì)的。可以非常有效地抽提小片段為180-200bp的DNA ladder，同時(shí)又可以抽提到大50kb左右的基因組DNA。本試劑盒可以抽提50個(gè)樣品。

DNA ladder也稱DNA fragmentation，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。通常觀察到DNA ladder，就可以判定細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

樣品首先被蛋白酶K消化，隨后加入適合DNA結(jié)合到純化柱上的緩沖液，然后加入到純化柱內(nèi)。通過高速離心，使DNA在穿過純化柱的瞬間，結(jié)合到純化柱上，隨后通過兩次洗滌去除各種雜質(zhì)，后通過洗脫液把DNA洗脫下來。整個(gè)過程無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。

通過DNA純化柱方式抽提DNA ladder比用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片段DNA不容易損失。試劑盒提供了RNase A，可以獲得不含RNA的高純度總DNA，排除了RNA對DNA ladder觀察造成的干擾。

本試劑盒每次多可以抽提20mg組織或200-350萬個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞。樣品用量過多，反而會(huì)影響抽提效果。純化柱對于DNA的大容量約為30微克。通常每200萬Hela細(xì)胞或500萬淋巴細(xì)胞可以抽提得到15-25微克總DNA，每25mg肝、腦、腎組織可以抽提得到10-30微克總DNA，每25毫克心、肺組織可以抽提得到5-10微克總DNA，每10mg脾組織可以抽提得到5-30微克總DNA。樣品的用量請勿超過純化柱的容量，樣品用量好能保持在純化柱容量的70%或以下。當(dāng)然過少的樣品也不利于檢測到DNA ladder。

對于培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡檢測，通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞就足夠用于DNA ladder的抽提和檢測。

試劑盒組份：

樣品裂解液A——————10ml

樣品裂解液B——————11ml

洗滌液I——————21ml(第一次使用前加入7ml無水乙醇)

洗滌液II——————16ml (第一次使用前加入24ml無水乙醇)

洗脫液——————22ml

蛋白酶K——————1.1ml

RNase A——————220μl

DNA純化柱及廢液收集管——————50套

儲存條件：室溫，有效期一年。( 蛋白酶K需-20℃保存)
公司產(chǎn)品僅供科研使用，下列是產(chǎn)品屬性：

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作程序：

注意：最重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。

1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。

3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。

4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。

6.后固定：消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。

8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。

9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗

11.滴加化鼠抗*：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

13.滴加化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。

14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。

15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。

16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。

注意事項(xiàng)：

①加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。

②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。

③按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

④底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時(shí)間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

⑤洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。

⑦實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

⑧試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

⑨不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

粘蛋白/粘液1(MUC1)英文名稱：MUC1 ELISA Kit血管生成相關(guān)蛋白6抗體包裝1g

再生基因蛋白1a(REG-1a)英文名稱：REG-1a ELISA KitMuellerian繆勒管激抑制因子抗體包裝5g

載脂蛋白H(Apo-H)英文名稱：Apo-H ELISA Kit酪蛋白激受體A8抗體包裝1g

載脂蛋白E(Apo-E)英文名稱：Apo-E ELISA Kit脂肪酰家族成員1抗體包裝5g

載脂蛋白B48(apo-B48)英文名稱：apo-B48 ELISA Kit芳香烴受體核轉(zhuǎn)錄蛋白樣2抗體包裝100mg

載脂蛋白B100(apo-B100)英文名稱：apo-B100 ELISA Kit磷化芳香N-乙?；D(zhuǎn)移抗體包裝1g

載脂蛋白B100(Apo B100)英文名稱：Apo B100 ELISA Kit肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白1抗體包裝500mg

載脂蛋白B(ApoB)英文名稱：ApoB ELISA Kit粘附分子IgG樣結(jié)構(gòu)域蛋白2抗體包裝5g

載脂蛋白A5(apo-A5)英文名稱：apo-A5 ELISA Kit肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白DOC6抗體包裝100mg

載脂蛋白A1(apo-A1)英文名稱：apo-A1 ELISA KitAFG3樣蛋白2/脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)蛋白28抗體包裝500mg

載脂蛋白A1(Apo A1)英文名稱：Apo A1 ELISA Kit激活受體相互作用蛋白1抗體包裝1g

孕受體(PROGR)英文名稱：PROGR ELISA Kit固類還原家族7成員A2抗體包裝5g

孕(PROG)英文名稱：PROG ELISA Kit蛋白激AKT1,2,3抗體包裝25g

孕激/孕(PROG)英文名稱：PROG ELISA Kit帕金森病相關(guān)蛋白ATP13A2抗體包裝5g

誘導(dǎo)型一氧化合成(iNOS)英文名稱：iNOS ELISA Kit肌側(cè)索硬化蛋白2抗體包裝100g

繆勒激2型受體抗體Ⅱ型膠原(COL2)AT-406 是一種有效的，可口服的 Smac 模擬物，為 IAPs 的拮抗劑，能夠抑制 XIAP，cIAP1 和 cIAP2 蛋白，Ki 值分別為 66.4，
細(xì)胞凋亡DNA Ladder提取試劑盒(柱式吸附)空泡單胞 N-2-乙?；BⅠ型前膠原羧基端肽Elisa

都柏林沙門氏 肝瓊脂糖凝膠CL-6BⅡ型肺泡表面抗原Elisa

畢赤酵母屬 聚氧乙烯氫化Ⅱ型膠原C端肽Elisa

枯草芽孢桿 (-)-莰Ⅱ型膠原抗體Elisa

肉座屬 牛肉浸粉Ⅲ型膠原蛋白Elisa

少根根霉 油酸乙酯Ⅲ型前膠原氨基端肽Elisa

大腸埃希氏○抗原微量凝集定型血清診斷液 ○106 3'-甲氧基-5'-羥基異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷Ⅳ型膠原Elisa

釀酒酵母 Ⅳ型膠原蛋白Elisa

殼多胞屬 鼠尾草酸Elisa

粗壯假絲酵母 蜂膠Ⅸ型膠原蛋白Elisa

運(yùn)動(dòng)節(jié)桿 甲基紫精adropinElisa

枯草芽孢桿 月桂聚氧乙烯硫酸鈉AKT蛋白Elisa

Pseudomonas argentinensis DA201-C樹脂AP2A2Elisa

馬腺疫鏈球獸疫亞種 1，1-二苯基-2-苦基肼脂肪炎癥因子Elisa

枯草芽孢桿 長春apelin 12Elisa