彈狀病毒PCR檢測試劑盒說明書

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Tiron石油 AR,bp 90-120 °C十八胺 ≥97.0% (GC)

Ferrocene酸烯酯 98%辛胺 99%

Lead氯甲酸芐酯 96%十八胺 ≥99.0% (GC)

Lead2-氯異酸乙酯 97%1,3-二胺 98%

Lead環戊 99%聚二烯二甲基氯化銨溶液 Mw <100,000 ,35 wt. % 溶液，100-200

LeadN,N-二苯基氯甲酰胺  98%聚二烯二甲基氯化銨溶液Mw 100,000-200,000 ,20 wt. % 溶液，6

Lead acetate trihydrate氯甲酸異丁酯 98%Mw 200,000-350,000 ,20 wt. % 溶液，250-500 cP (25 °C)

Lead oxide red氯甲酸異酯  97%Mw 400,000-500,000 ,20 wt. %溶液，800-1000 cP (25 °C)

Lead oxide yellow4-甲基環己酮 98%三月桂胺 95%

Lead(II)borate氯甲酸-4-硝基芐酯 97%三辛胺 90%

Lead(II)carbonate吡唑 99%十四胺 96%

Lead chromate1,5-戊二 97%鈦酸鋇 粉末, <2 μm, 99.5% metals basis

Lead hydroxide氯甲酸苯酯 98%鈦酸鋇 99.99% metals basis

Lead(II)iodide氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯 97%納米鈦酸鋇 99.9% metals basis,<100 nm

Lead(IV)acetate氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯 99%D-木糖 98%

Lead(II)acetate basic2,2,2-三 98%異煙酸 AR,99%

乙(>99.5%(GC))Neogenin (D7M8E) Rabbit mAbJunctophilin 3  連接蛋白JPH3抗體

庚烷(>99.0%(GC))Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)Jun D  活化蛋白激酶D抗體

乙酸乙酯(>99.5%(GC))Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb (Biotinylated)Jun B  活化蛋白激酶B抗體

乙酸丁酯(>99.0%(GC))HDAC3 (7G6C5) Mouse mAbJNK3/MAPK10  氨基末端激酶3抗體

乙酸異戊酯(>98.0%(GC))HDAC3 (7G6C5) Mouse mAbJNK2  氨基末端激酶2抗體

乙(>99.5%(GC))SOCS1 (A156) AntibodyJNK1/3  氨基末端激酶1/3抗體

苯(>99.5%(GC))SOCS1 (A156) AntibodyJNK1/2/3  氨基末端激酶1/2/3抗體

1-丁(>99.0%(GC))MST2 AntibodyJMY  連接介導調節蛋白抗體

溴(含穩定劑二苯胺)(>99.0%(GC))MST2 AntibodyJMJD7  組蛋白去甲基轉移酶JMJD7抗體

環己烷(>99.5%(GC))HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)JMJD6  凋亡細胞清除受體抗體
彈狀病毒PCR檢測試劑盒說明書4號染色體開放閱讀框21抗體Burchellin中文名：別名：分子式：C20H20O5

緊密連接蛋白2抗體(±)-Piresil中文名：(±)-松脂素別名：松脂酚分子式：C20H22O6

緊密連接蛋白7抗體Isodihydrofutoquil B中文名：別名：Lancifolin E分子式：C21H24O5

補體C3cα片段2抗體Isodihydrofutoquil A中文名：別名：Lancifolin F分子式：C21H24O5

補體C3cα 鏈片段1抗體5'-Methoxylariciresil中文名：5'-甲氧基落葉松樹脂醇別名：分子式：C21H26O7
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。