桃拉綜合癥病毒PCR檢測試劑盒說明書

?
注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
3,4-DimethoxyphelN,N-二甲基對苯二胺 99%,用于過氧化物酶試驗硝酸 電子級

3,4-Dimethoxyphenyl beta-D-glucosideN,N-二甲基對苯二胺 AR，環(huán)保試劑,96%硫酸 AR,95-98%（）

3,4’-Di-O-methylellagic acid三十二烷 98%硫酸 99.999% metals basis

L-Alanine二苯氨基脲 AR四丁基磷酸二氫銨 98%

D-Alanine乙 for HPLC, >99.0%(GC)，含2%乙作穩(wěn)定劑間氨基苯甲酸 99%

DL-Alanine二甲基黃 indicator對氨基苯甲酰胺 98%

β-Alanine砷試劑 AR,99.0%2,2-雙[4-(4-氨基苯氧基)苯基]烷 98%

BOC-L-Alanine1,2-二氯乙烷 standard for GC,>99.9%(GC)對氨基苯甲酸丁酯 98%

BOC-D-Alanine1,3-二氨基－4-(5-溴-2-吡啶偶氮)苯 AR雙(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)癸二酸酯 98%

L-Alanine ethlester hydrochloride2-(3,5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚 AR4,4'-雙(4-氨苯氧基)聯(lián)苯 97%

D-Alanil二乙氨基乙基纖維素-1 TLC2,2-二(3-氨基-4-羥苯基)六氟烷 98%

L-Arginine二甲基黃 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98.0% (HPLC)3,3',4,4'-聯(lián)苯四甲酸二酐 97%

D-Arginine二十烷 standard for GC,>99%(GC)1,4-環(huán)己烷二羧酸(cis + trans) 99%

DL-Arginine二十烷 AR2,2'-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮 98%

L-Arginine HCL二十烷  99%4、4'-二氨基苯酰替苯胺 98%

L-精氨酸琥珀酸鋇鹽二十烷 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.5% (GC)2,4-二羥基苯甲 98%

標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/ml,溶劑：）p35/25 (C64B10) Rabbit mAbPDXK  吡哆激酶抗體

標(biāo)準(zhǔn)溶液（100µg/mL,基體：）Acetyl-Histone H3 (Lys14) (D4B9) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)PDX1  胰島素促進因子抗體（胰十二指腸同源異型盒蛋白）

鉍標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/ml,溶劑:1.5 mol/L H3）IKKα AntibodyPDSS2  抑癌蛋白DLP1抗體

鉍標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/ml,溶劑:1.0 mol/L H3）Phospho-Atg13 (Ser355) (D6J1W) Rabbit mAbPDPK1  3磷酸肌依賴性蛋白激酶1抗體

鈹標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/ml,基體:1.5 mol/L H3）PKCε (22B10) Rabbit mAbPDLIM3/ALP  輔肌動蛋白相關(guān)LIM蛋白抗體

銅標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000mg/l,溶劑：1%硫酸）IKKβ AntibodyPDLIM1  細(xì)胞骨架蛋白C端PDLIM1抗體

銅標(biāo)準(zhǔn)溶液（500mg/l,溶劑:1%硫酸）IKKγ AntibodyPdk4  酮酸脫氫酶激酶4抗體

鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液（三價鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液1000μg/ml）OGDH (E1W8H) Rabbit mAbPDK2  酮酸脫氫酶激酶亞型2抗體

鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液（500mg/L,溶劑：）Phospho-IKKγ (Ser376) AntibodyPDIA2/PDI  蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抗體

鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液（100µg/mL,基體：）IKKε AntibodyPDI/P4HB/ERBA2L/PDIA3  蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抗體
桃拉綜合癥病毒PCR檢測試劑盒說明書Sodium D-pantothenate,99%通用試劑　5G

2,3,5-Triiodobenzoic acid,98%通用試劑　5G

γ-Lilenic acid,≥99%通用試劑　10MG

Humic acid通用試劑　10G

Amiphylline hydrate,98%通用試劑　25G

(2′Z)-Indirubin (HPLC,≥98%)通用試劑　5MG

α-Hydroxyisobutyric acid,99%通用試劑　5G

9,10-Phenanthrenequine,95%通用試劑　5G

12-Amilauric acid,95%通用試劑　5G

Kainic acid mohydrate,≥99%通用試劑　5MG

Cyclopentadienyl iron(II) dicarbonyl d...通用試劑　1G

N-Acetylsulfanilyl chloride,98%通用試劑　25G

3,4-Dimethoxybenzyl alcohol,96%通用試劑　5G

Benzamidine hydrochloride hydrate,≥99%通用試劑　5G

3-Hydroxyphenylacetic acid,≥99%通用試劑　1G