布氏錐尾線蟲PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Cyclo(Tyr-Phe)LB肉湯 BR三氯叔丁 藥用級(jí)

Cyclo(Tyr-Pro)麥芽浸膏 BR三氯叔丁 98%

Cyclo(Tyr-Val)麥芽浸膏 BR三氯叔丁 分析標(biāo)準(zhǔn)品

Cyclo(Val-Hpro)M湯 BR無(wú)檸檬酸 AR, ≥99.5% (T)

D-arabinitol馬鈴薯葡萄糖瓊脂 BR蓖麻油 USP級(jí)

Dencichin馬鈴薯葡萄糖肉湯 BR蓖麻油 CP

Deoxymorellin雙糖鐵尿素瓊脂 BR玉米油 試劑級(jí)

Deoxyjirimycin hydrochloride改良V-P培養(yǎng)基 BR玉米油 藥用級(jí)

DesoxygambogeninV-P半固體瓊脂 BR尼泊金乙酯 CP,99.0%  

D-Glucosamine hydrochloride我妻氏培養(yǎng)基基礎(chǔ) BR羊毛脂 藥用級(jí)

D-(+)-GlucoseDL-泛  99%羊毛脂 CP

Diallyl disulfide氯化鉍 ARDL-蘋果酸 AR，99.5%

Dihydrorotene溴化亞銅 CP,99.0%山梨酸 >99.0%(T)

Dimethylamipyridine檸檬酸銅 AR,99.5%山梨酸 CP,98%

Dipalmitin乙酸銅 一合物  AR,99.0%山梨酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品

Doxycycline乙酸銅 一合物  CP,98.0%山梨酸 藥用級(jí)

氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1000mol/L(0.1N))SimpleChIP® Human c-Fos Upstream Primersphospho-ATG4C(Ser166)  磷酸化自噬相關(guān)蛋白4C抗體

草酸鈉容量分析用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Phospho-PLCγ1 (Tyr783) (D6M9S) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)phospho-ATG4A(Ser100)  磷酸化自噬相關(guān)蛋白4A抗體

硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1017mol/L)Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibodyphospho-ATG3 (Tyr18)  磷酸化自噬相關(guān)蛋白3抗體

硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1000mol/L(0.1N))Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibodyphospho-ATG16A(Ser287)  磷酸化自噬相關(guān)蛋白16A抗體

硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.01000mol/L(0.01N))Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibodyphospho-ATG16A(Ser213)  磷酸化自噬相關(guān)蛋白16A抗體

百里香酚藍(lán)(IND)Human Insulin-like Growth Factor II (hIGF-II)Phospho-ATG1(Ser556)  磷酸化自噬相關(guān)蛋白1抗體

百里香酚藍(lán)(ACS reagent,95 %)TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAbphospho-ATF4/CREB-2(Ser245)  磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子4抗體

喹哪啶紅TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAbphospho-ATF2(Thr69/71)  磷酸化活化復(fù)制因子2抗體

酚酞(98%)Acetyl-p53 (Lys379) Antibodyphospho-ATF2(Ser94)  磷酸化活化復(fù)制因子2抗體

四溴酚藍(lán)Acetyl-Histone H2B (Lys20) Antibodyphospho-ATF2(Ser472)  磷酸化活化復(fù)制因子2抗體
布氏錐尾線蟲PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書4-Piperidone hydrate hydrochloride通用試劑　10G

D-Allylglycine hydrochloride通用試劑　250MG

N-Amipiperidine hydrochloride通用試劑　5G

Chlorodipyrrolidicarbenium hexafluor...通用試劑　5G

DMTMM通用試劑　1G

(R)-3-Hydroxypyrrolidine hydrochloride通用試劑　1G

3-Hydroxyazetidine Hydrochloride,≥98.0%通用試劑　250MG

2-(Chloromethyl)-4-methoxy-3,5-dimethy...通用試劑　5G

S-Methylisothiourea Sulfate,≥98.0%通用試劑　100G

DL-Homocysteine thiolactone hydrochlor...通用試劑　25G

4-Pyridineacetic Acid Hydrochloride,≥...通用試劑　1G

1-Amidipyrazole Hydrochloride通用試劑　5G

Isonicotiyl chloride hydrochloride,...通用試劑　5G

Mebhydrolin napadisylate通用試劑　1G

Memantine Hydrochloride通用試劑　250MG
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。