阿尼昂尼昂病毒PCR檢測試劑盒說明書

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注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
Luciferase from Bacteria固藍B 90%N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酸亞胺基)脲六氟磷酸鹽  98% 好

Luciferase firefly高鐵試劑 98.5%三(N,N-四亞甲基)磷酰胺 98%

Maltose Phosphorylase固藍BB鹽 AR1-對甲苯磺?；?3-硝基-1,2,4-三唑  98%

Microcococcus lysodeikticus cells4-氟-3-硝基三氟甲苯 99%1-對磺酰咪唑 99%

Mutarotase核黃素-5′-磷酸鈉鹽合物 73-79%(HPLC)O-(N-琥珀酰亞胺基)-N N N'N'-四甲基四氟酸脲  97%

Phosphodiesterase I from Crotalus adamanteus vem戊菊酯 分析標準品，2,4,6-三吡啶基三  99%

Phosphodiesterase II from bovine spleen甲脒鹽酸鹽 96%三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽 98%

PLA2(+)-葑酮 standard for GC, ≥99.5% (GC)疊氮基*基硅烷 93%

PAO甲酸 for LC-MS, ~98% (T)O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟酸酯 98%

 Protease S Aureus固黑K鹽 80%2,4,6-三異基苯磺酰氯 97%

UTI固紅 3 GL Biological stainN,N,N′,N′-四甲基氯甲脒六氟磷酸鹽 99%

COMT固紅RC 生化試劑級N,N,N',N'-四甲基-O-(3,4-二氫-4-氧代-1,2,3-苯并三-3-基)脲四

Irganic Pyrophosphatase固紅TR半氯化鋅鹽 90%N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸鹽 98%

Phosphorylase b from rabbit muscle固紫B鹽 80%伍德沃德氏試劑K 98%

Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokkoN-甲酰-L-甲硫氨酰-L-白氨酰-L苯氨酸 97%魏因勒卜鏈接劑 98%

β-N-Acetylglucosaminidase(S)-(-)-2-甲酰胺琥珀酸酐 90%,工業(yè)級印刷標簽,用于25G(ML)及以下包裝,尺寸: 94mm*28mm

尼索地平Tyrosinase  酪氨酸酶(多肽抗原)SLC16A7/MCT2  單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白2抗體

尼索地平（標準品）OAT4L又稱URAT1 (Urate Transporter 1)  尿酸鹽重吸收轉(zhuǎn)運子1 (抗原)SLC16A3/MCT4  單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白3/4抗體

布洛芬VAP1(vascular adhesion protein 1)  血管粘附蛋白1（多肽抗原）SLC14A1/RACH1  尿素轉(zhuǎn)運型糖蛋白抗體

布洛芬（標準品）Vimentin  波形蛋白（抗原）SLC12A3/NCCT  鈉氯離子轉(zhuǎn)運蛋白抗體

馬來酸依那普利VSIG4 (V-set and immuglobulin domain-containing protein 4)  VSIG4 T淋巴細胞負調(diào)節(jié)蛋白之一（抗原）SLAMF9/CD2F-10  CD2F-10抗體

馬來酸依那普利（標準品）WNK4(Ser/Thr-protein kinase WNK4; protein kinase with  lysine 4; protein kinase, lysine –dficient 4)  一種新的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員的基因WNK4（多肽抗原）SLAMF9  CD2F-10抗體

氟尿嘧啶,5-氟脲嘧啶,5-氟尿嘧啶ZNF300 (zinc finger protein ZNF300)- middle  鋅指蛋白300(抗原)SLAMF7/CD319  SLAMF7抗體

氟尿嘧啶,5-氟脲嘧啶,5-氟尿嘧啶（標準品）ZNF268 (zinc finger protein ZNF268)- N-terminal (1a)  鋅指脂蛋白-1a(抗原)SLAMF6  SLAMF6抗體

琥珀酸舒馬曲普坦ZNF268 (zinc finger protein ZNF268)- middle (1b)  鋅指脂蛋白-1b(抗原）Skp2/skp2 p45  細胞S期激酶相關(guān)蛋白2抗體

琥珀酸舒馬曲普坦(標準品)ZNF268 (zinc finger protein ZNF268)- middle (1c)  人鋅指脂蛋白-1c(抗原)SKP1  S期激酶相關(guān)蛋白1抗體
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