東方蜜蜂微孢子蟲PCR檢測試劑盒說明書

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Proteinase K莰烯  95%黃磷 GR（）

Proteinase K solution(+/-)-兒茶精 分析標準品過氧乙酸 AR,18-20%

Pepstatin A(+/-)-兒茶精 96%過氧乙酸 21-25%

Rnasin Inhibitor（＋）－兒茶素  分析標準品，>98%過氧乙酸 26-30%

STI（＋）－兒茶素  98%過氧乙酸 31-35%

Aprotinin咖啡酸 分析標準品過氧乙酸 36-40%

AMV Reverse transcriptase腦磷脂 98%，氬氣封裝過氧乙酸 41-45%

M-MLV Reverse transcriptase桂皮 分析標準品，99%過氧乙酸 46-50%

SuperScript II Reverse Transcriptase桂皮 98%過氧乙酸 高純度，醫用級，5%（1Gal/PE）

CIAP結晶紫 分析標準品過氧乙酸 15-17%

Urease(jack bean)環庚烷 97%發煙硫酸 AR

Leupeptin(S)-(-)-β-香茅  99%發煙硫酸 65%

Thio-NAD檸檬酸 一  ≥99.9998% metals basis結晶四氯化錫 AR,99.0%  

β-DPN細胞松弛素B 98%結晶四氯化錫  99.995% metals basis

β-DPNH葉綠素b 95%硫脲 AR，99%

NADH Inhibitor4-氯苯甲 分析標準品硫脲 CP，98%

醋酸舍莫瑞林 Leptin receptor  瘦素受體（抗原）Snail/SNAI 1  Snail蛋白抗體

磺胺嘧啶銀Lpin1 protein  Lpin1 protein(抗原)SNAI2/SLUG  鋅指轉錄因子Slug抗體

磺胺嘧啶銀(標準品)Lumbrokinase  蚯蚓纖溶酶(蚓激酶抗原)SMYD4  組蛋白甲基轉移酶SMYD4抗體

辛伐他汀 Livin (Inhibitors of apoptosis proterins Livin)  一種新的凋亡抑制蛋白(抗原)SMYD3  組蛋白甲基轉移酶SMYD3抗體

辛伐他汀,辛伐他丁（標準品）p38 MAPK/MKK3/MAPKK14  絲裂原活化蛋白激酶p38(抗原)SMYD2  組蛋白甲基轉移酶SMYD2抗體

康普瑞汀磷酸二鈉鹽Metal ion transporter  擬南介金屬離子轉運蛋白(抗原)SMURF2  Smad蛋白E3泛素連接酶2抗體

硫酸西梭米星/硫酸西索霉素MADCAM-1  黏膜選址素（抗原）SMURF1  Smad蛋白E3泛素連接酶1抗體

硫酸西梭米星(標準品)MAG-a/b (Myelin associated glycoprotein; L / S -MAG;)  髓鞘相關糖蛋白a/b(抗原)SMS2/Sphingomyelin Synthase 2  鞘磷脂合成酶2抗體

生長抑素MAG (Myelin associated glycoprotein; L-MAG;MAG-a )  髓鞘相關糖蛋白(抗原)Smoothened/SMO  跨膜蛋白Smoothened抗體

甲苯磺酸索拉非尼MMP-1(Mous ematrix metalloproteinases-1)  基質金屬蛋白酶-1（小鼠抗原）SMOC2  分泌模塊化鈣結合蛋白2抗體（平滑肌相關蛋白2）
東方蜜蜂微孢子蟲PCR檢測試劑盒說明書人干擾素誘導蛋白10(IP-10/CXCL10)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1公斤

人干細胞因子/肥大細胞生長因子(SCF/MGF)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1000只/袋

人干細胞因子受體(SCFR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1包

人剛地弓形蟲(T.gondii)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1000只/袋

人高爾基蛋白73(GP-73)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

人高分子量細胞角蛋白(CK-HMW)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1塊

人高靈敏度促甲狀腺激素(U-TSH)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1000只/袋

人高密度脂蛋白(HDL)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1包
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。